缺氧诱导因子-2α通过血管生成素-2途径调控缺氧诱导血管形成的研究

摘要：目的 探讨缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)调控缺氧环境下内皮细胞血管形成的机制.方法 采用实验研究方法.(1)细胞分组:取对数生长期人类脐静脉内皮细胞(HUVECs):细胞不做任何处理设为空白对照组,细胞转染对照shRNA设为空载体组,细胞转染HIF-2α shRNA设为HIF-2α沉默组,细胞转染HIF-2α shRNA后加入rh-Ang-2设为HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组.(2) Western blot检测:①缺氧环境下培养0、2、4、8、12、16、20 h的HUVECs中血管生成素-2(Ang-2)和HIF-2α的蛋白表达量.②检测空白对照组、空载体组和HIF-2α沉默组HUVECs中Ang-2和HIF-2α的蛋白表达量.(3)ELISA检测:检测空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组HUVECs上清液中Ang-2水平.(4)小管形成实验检测:空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs中内皮细胞小管数目.(5)Transwell法检测细胞迁移:①空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs迁移细胞数目.②空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs上清液干预肝癌细胞SMMC-7721后,肝癌细胞SMMC-7721迁移数目.正态分布的计量资料以-x±s表示,重复测量数据采用重复测量的方差分析,多组间比较采用单因素方差分析并采用Dunnett's test进行组间两两比较.结果 (1) Western blot检测相关蛋白表达量:①HUVECs缺氧培养0、2、4、8、12、16、20 h细胞中Ang-2的表达量分别为0.110±0.011、0.120±0.020、0.210±0.070、0.410±0.100、0.520±0.090、0.790±0.130、1.010±0.220;HIF-2α的表达量分别为0.180±0.090、0.410 ±0.070、0.470±0.110、0.470±0.070、0.580 ±0.120、0.690 ±0.140、0.920±0.130,经缺氧处理后两种蛋白表达量均有增高,且随缺氧时间延长,表达量呈升高趋势,差异有统计学意义(F =403.550,3 265.587,P＜0.05).②空白对照组、空载体组和HIF-2α沉默组HUVECs中Ang-2的蛋白表达量分别为1.030 ±0.180、1.070 ±0.120、0.210±0.070,HIF-2α分别为0.940±0.110、0.930 ±0.190、0.170±0.021,3组上述指标比较,差异均有统计学意义(F=290.242,26.688,P＜0.05).(2)ELISA检测结果显示:空白对照组、空载体组和HIF-2α沉默组HUVECs中Ang-2表达量为(433.2±9.7)ng/L、(438.3±2.6)ng,/L、(114.6 ±4.2)ng/L,3组比较,差异有统计学意义(F=2 642.180,P ＜0.05).(3)小管形成实验结果显示:空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs中内皮细胞小管数目分别为(48.3±2.5)个、(47.4±3.1)个、(19.7±1.5)个、(38.3±2.1)个,4组比较,差异有统计学意义(F=148.196,P＜0.05).(4) Transwell法检测细胞迁移结果:①空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs中,迁移细胞数目分别为(140.3±3.5)个、(142.7±2.1)个、(42.7±3.1)个、(78.1±4.2)个,4组比较,差异有统计学意义(F=212.205,P＜0.05).②Transwell法检测4种不同上清液干预的SMMC-7721细胞迁移结果:空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组上清液分别处理SMMC-7721细胞后,其细胞迁移数目分别为:(106.7±5.5)个、(102.7±6.6)个、(63.0±3.3)个、(96.7±2.1)个,4种处理方式比较,差异有统计学意义(F =55.122,P＜0.05).结论 HIF-2α可通过Ang-2调控缺氧下内皮细胞的血管形成,并通过内皮细胞分泌的Ang-2促进肝癌细胞SMMC-7721迁移.