肝癌中星形细胞上调基因1作用于microRNA-885-5p/基质金属蛋白酶9信号通路促进肝癌转移的机制研究

摘要：目的 探讨星形细胞上调基因-1(AEG-1)与microRNA-885-5p的关系,观察microRNA-885-5p对肝癌细胞MHCC-97H迁移和侵袭能力的影响,鉴定microRNA-885-5p的靶基因,揭示AEG-1促进肝癌转移的机制.方法 采用实验研究方法.构建AEG-1过表达质粒,合成沉默AEG-1的siRNA,分别瞬时转染进MHCC-97H细胞.对于转染质粒,以转染空载体Vector NC的MHCC-97H细胞作对照,设为A组;转染AEG-1过表达质粒的MHCC-97H细胞设为B组.对于转染AEG-1 siRNA,以转染阴性对照siRNA的MHCC-97H细胞作对照,设为C组;转染AEG-1 siRNA的MHCC-97H细胞设为D组.采用荧光定量PCR分别检测A、B、C、D组MHCC-97H细胞中microRNA-885-5p相对表达量.对于转染microRNA-885-5p模拟体,以转染阴性对照microRNA模拟体的MHCC-97H细胞作对照,设为E组;转染microRNA-885-5p模拟体的MHCC-97H细胞设为F组.采用Transwell小室法检测E、F组MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力.采用Targetscan软件,预测microRNA-885-5p的靶基因.将靶基因报告质粒和阴性对照siRNA共转染进MHCC-97H细胞作对照,设为G组;将靶基因报告质粒和microRNA-885-5p模拟体共转染进MHCC-97H细胞,设为H组.将结合位点突变的靶基因报告质粒和阴性对照siRNA共转染进MHCC-97H细胞作对照,设为Ⅰ组;将结合位点突变的靶基因报告质粒和microRNA-885-5p模拟体共转染进MHCC-97H细胞,设为J组.检测G、H、I、J组细胞荧光素酶活性.在MHCC-97H细胞中转染阴性对照siRNA,设为K组;转染microRNA-885-5p模拟体,设为L组,采用Western blot检测各组中microRNA-885-5p靶基因蛋白相对表达量.将microRNA-885-5p靶基因siRNA转染进MHCC-97H细胞,设为M组;将阴性对照siRNA转染进MHCC-97H细胞,设为N组.采用Transwell小室法检测M、N组MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力.符合正态分布的计量资料以x±s表示,两组间比较采用t检验.结果 A组MHCC-97H细胞中microRNA-885-5p的相对表达量为(10.68±1.32)×10-4,B组为(5.02±0.20)×10-4,两组比较,差异有统计学意义(t=7.357,P＜0.05).C组MHCC-97H细胞中microRNA-885-5p的相对表达量为(11.04±0.97) ×10-4,D组为(24.15 ±3.71) ×10-4,两组比较,差异有统计学意义(t =5.920,P ＜0.05).MHCC-97H细胞迁移实验结果:E组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 452±212)个,F组为(778±95)个,两组比较,差异有统计学意义(t=5.018,P＜0.05).MHCC-97H细胞侵袭实验结果:E组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 237±238)个,F组为(470 ±70)个,两组比较,差异有统计学意义(=5.353,P＜0.05).预测到一条靶基因候选者为MMP9.G组MHCC-97H细胞荧光素酶活性为0.73±0.03,H组为0.46±0.04,两组比较,差异有统计学意义(t=8.623,P＜0.05).检测到结合位点突变报告质粒mutMMP9.Ⅰ组MHCC-97H细胞荧光素酶活性为0.69±0.03,J组为0.64±0.08,两组比较,差异无统计学意义(t=0.934,P＞0.05).K组MHCC-97H细胞中MMP9蛋白相对表达量为0.75±0.03,L组为0.25±0.03,两组比较,差异有统计学意义(t=19.086,P＜0.05).MHCC-97H细胞迁移实验结果:M组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 210±163)个,N组为(537±16)个,两组比较,差异有统计学意义(t=7.111,P＜0.05).MHCC-97H细胞侵袭实验结果:M组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 192±170)个,N组为(374-±55)个,两组比较,差异有统计学意义(t=7.916,P＜0.05).结论 AEG-1负调控microRNA-885-5p的表达,microRNA-885-5p的靶基因为MMP9,micro-RNA-885-5p通过负调控MMP9,起到抑制肝癌细胞迁移和侵袭的作用.